Ludger是一家生物科學公司，專門研究糖生物學的醫(yī)學應用分析技術。該技術起源于英國牛津大學。它在范圍內用于FDA和EMEA批準的生物藥品的質量控制中，并可用于支持IND提交。我們從1999年開始運營，已建立了一個客戶群，包括*的制藥和生物技術公司。

LudgerTagTM DMB唾液酸試劑盒產品指南

Ludger LT-KDMB-A1說明書

Ludger文件編號LT-KDMB-A1-Guide-v6.3

LT-KDMB-A1的質量標準

應用 用于從糖蛋白中釋放唾液酸，并用1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯標記。2HCl(DMB)。

染料性質 相對分子量 = 225.07 gmol-1

熒光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。

結構

O NH₃Cl

O NH₃Cl

同義詞 DMB；1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯2鹽酸鹽；1,3-苯并二氧雜-5,6-二胺2鹽酸鹽；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧雜唑2鹽酸鹽

描述 該試劑盒含有用于從糖蛋白中釋放唾液酸的試劑。釋放的唾液酸通過胺化環(huán)化反應與DMB染料結合。

樣本數量該試劑盒包含用于多達22份樣本的試劑和材料，包括唾液酸參比組以及N-乙酰神經氨酸和N-羥乙酰神經氨酸定量標準品。

樣品量 通常每次分析從50-200µg糖蛋白開始。我們建議一式三份分析樣本。

適用樣本 可以標記糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的任何唾液酸。

儲存條件： Store at -18 ℃下避光儲存。避免熱源、光源和濕氣。提供的試劑至少可穩(wěn)定保存2年。

運輸： 產品可在環(huán)境溫度下運輸。

處理： 確保使用的任何玻璃、塑料制品或溶劑不含糖苷酶和環(huán)境碳水化合物。所有樣本處理程序均使用無粉手套，并避免環(huán)境碳水化合物污染。

單瓶試劑開封后，應立即使用其內容物。根據當地安全規(guī)則，丟棄任何多余部分。

安全性： 僅供研究使用。不用于人體或藥物

請閱讀所有所用化學品的安全數據表(SDS)。涉及標記試劑的所有過程均應使用適當的個人安全防護-眼鏡、耐化學腐蝕的手套（例如腈），并在適當的情況下在實驗室通風櫥中進行。

試劑盒內容物

每個試劑盒包含以下各一瓶：

所需的其他試劑和設備

• 加熱塊、烘箱或類似的干燥器，設置為80 ℃用于唾液酸釋放；設置為50 ℃用于唾液酸標記反應
• 移液器范圍1-1000µL和吸頭
• 真空離心機
• 反應瓶（例如0.5 mL聚丙烯瓶）
• 分析級水，例如。毫居里
• 如果需要復制品，則添加唾液酸標準品[可選]：CM-NEUAC-01；CM-NEUGC-01
• 其他唾液酸標準品Neu5,9Ac2[可選]： CM-NEU5,9AC-01
• 工藝陽性對照品[建議]：Ludger胎球蛋白糖蛋白 GCP-FET-50U

Ludger Bioquant糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U

貼標時間線

LudgerTag™標記程序，包括干燥時間和唾液酸從

分析樣品，通常需要7小時加上干燥：

程序 時間

樣品制備 10 min + 干燥(1-2 h)，可在前一天進行

唾液酸的釋放 3 h

DMB標記 3.5 h

總時間： 7 h + 干燥

方法

1. 樣品制備
   • 我們建議通過分析取一式三份樣品。對于高唾液酸化糖蛋白，使用50µg，對于唾液酸化水平較低的IgG等樣品，使用高達200µg。

• 請注意，一些常用于蛋白質的鹽/緩沖液可能會干擾唾液酸分析過程。這取決于與緩沖液體積相比采集的樣品量（因為大量緩沖液可能影響酸水解過程中溶液的酸度）。在我們的  經驗緩沖液（如PBS）在樣品濃度高于1 mg/mL且采集50-200µg樣品進行分析時不存在問題。

• 我們建議您在整個過程中對樣品進行多次控制：陽性過程控制糖蛋白：胎球蛋白糖蛋白：GCP-FET-50U陽性過程定量控制糖肽：BQ-GPEP-A2G2S2-10U陰性過程控制：水

陰性過程對照：樣品緩沖液

• 將樣品和過程控制等分試樣（除非已經干燥）置于0.5 mL聚丙烯小瓶中，并在真空離心機中干燥。

1. 唾液酸釋放
   • 將柱溫箱設定為80 ℃

• 向樣品和過程控制小瓶中加入25µL 2M乙酸溶液。

不符合唾液酸標準：Neu5Ac(CM-NEUAC-01)、Neu5Gc(CM-NEUGC-01)、唾液酸參比組(CM-SRP-01)小瓶；或Neu5,9Ac2(CM-Neu5,9，Ac-01)（如使用）。

• 渦旋溶解，然后短暫離心。

• 將樣品和對照品置于設定為80 ℃的烘箱中，孵育2小時(±5 min)。從烘箱中取出，冷卻至室溫。渦旋并短暫離心。

• 從各樣品或過程對照品中取5µL，轉移至0.5 mL聚丙烯小瓶中，準備用DMB標記。

如果需要，酸釋放樣品可在-20 ℃下儲存至少2天[Ref1]。

1. DMB標簽
   • 將柱溫箱設定為50 ℃。

• 向連二亞*LT-DITHIO-01小瓶中加入440µL巰基乙醇溶液LT-MERCAPTO-01，并通過移液器吹打混合，直至固體*溶解。

• 將該溶液全部加入DMB Dye LT-DMB-01小瓶中，通過移液器吹打混勻，直至染料溶解。

避免標簽試劑暴露于潮濕和光照條件下，并在60 min內使用。

• 向各樣品和過程質控品中加入20µL標記試劑，蓋上試管蓋，渦旋混勻，然后短暫離心，確保標記溶液在小瓶底部。

• 向各唾液酸標準品（Neu5Ac、Neu5Gc、唾液酸參比組，必要時加Neu5,9Ac2）中加入20µL標記試劑，蓋上試管蓋，渦旋充分混勻，然后短暫離心，確保標記溶液在小瓶底部。

將樣品、對照品和標準品置于設定為50 ℃的烘箱中，并在  黑暗。

孵育期間，您可以開始調節(jié)LC，以備分析-參見第4節(jié)。

• 從烘箱中取出小瓶，向各樣品和過程控制中加入475µL水終止反應

向各唾液酸標準品中加入480µL水

1. LC分析

稀釋用于標準曲線的Neu5Ac和Neu5Gc標準品（使用表1作為指導，因為Neu5Gc的含量通常低于Neu5Ac，Neu5Gc曲線的范圍比Neu5Ac低一個步驟）?；靹?。

這可以在“HPLC條件色譜柱”運行正在進行時完成。

表1.標準品的稀釋方案

• 用水（20µL樣品 + 180µL水）以1:10（比例1:9）稀釋樣品。

• 用水以1:10（比例1:9）稀釋工藝對照品（和Neu5,9Ac2，如使用）。

• 請勿稀釋唾液酸參比盤(SRP)。

注：如果已知樣品具有低水平的唾液酸化（例如IgG）-則不要用水稀釋。如果發(fā)現LC峰面積不在標準曲線范圍內，則制備濃度更高的樣品或延長標準曲線。

樣品在自動進樣器中于10 ℃避光條件下可穩(wěn)定至少72 h[Ref2]。

• 準備LC系統(tǒng)。確保溶劑管線已預充。溶劑A = 乙腈：甲醇：水(9:7:84)

溶劑B = 乙腈

熒光：激發(fā)波長：373 nm；發(fā)射波長：448 nm；柱溫 = 30 ℃；樣品溫度 = 10 ℃

表2.采用LudgerSep-R1色譜柱（4.6 x 150 mm，3µm顆粒）LS-R1-4.6 x 150進行HPLC分析的30 min運行方法。

進樣量 = 25µL。

表3使用LudgerSep-uR2色譜柱（2.1 x 100 mm，1.9

µm微粒）LS-UR2-2.1 x 100。

進樣量 = 5µL。

• 通過運行適當方法（表2采用LudgerSep-R1色譜柱進行HPLC分析或表3采用LudgerSep-uR2色譜柱進行UHPLC分析）處理色譜柱，不進樣2/3次。然后進樣水系統(tǒng)空白，并檢查基線是否穩(wěn)定。如果不是，則保持流水進樣直至基線穩(wěn)定，或在再調節(jié)前用10%a和90%B清洗30 min。

• 然后運行2次或更多次SRP唾液酸參比組進樣，直至圖譜重疊。圖譜應類似于圖1(HPLC)或圖2(UHPLC)。然而，保留時間將根據使用的LC系統(tǒng)而變化。

• LC系統(tǒng)現在可以運行樣品組。我們建議按以下順序（表4）：

表4.樣品進樣順序

1. 驗收標準
   • 樣品集開始和結束時SRP的曲線應重疊，漂移極小

例如：±0.1 min。

• Neu5Gc和Neu5Ac的校準曲線R2值應 > 0.99。
• 根據內部SOP分析的胎球蛋白的Ludger可接受范圍為252-377 nmol/mg蛋白（其中，例如34µg胎球蛋白/50U）[參考文獻3]。當我們收集更多GCP-FET-50U的內部數據時，對該可接受標準進行了更新。歷史可接受范圍列于參考文獻3中，并附有詳細說明。
• 采用內部SOP分析的GPEP-A2G2S2的Ludger可接受范圍為5.6-8.4 nmol。

（這是通過定量NMR測定的量±20%）

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00

分鐘

圖1：在LudgerSep-R1 HPLC色譜柱上運行的DMB標記唾液酸參比組(CM-SRP-01)的色譜圖。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙?；恢茫?；* = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時間取決于您實驗室的HPLC系統(tǒng)設置。

0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50

分鐘

圖2：在LudgerSep-uR2 UHPLC色譜柱上運行的DMB標記唾液酸參比組。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙?；恢茫?；* = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時間取決于您實驗室的UHPLC系統(tǒng)設置。

參考文獻和相關文獻

1. Ludger文件：S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0，DMB標記唾液酸冷凍影響的測定。
2. Ludger文件：唾液酸分析的胎球蛋白質量標準-v2.0.唾液酸分析中胎球蛋白系統(tǒng)適用性標準品可接受標準的確定
3. Ludger文件：DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0，采用Ludger標準對DMB套件進行確認。
4. Ludger文件：關于“定量唾液酸分析”#APN002的應用說明

反應機制

標記反應是一個2步過程。

1. 首先是將閉環(huán)（環(huán)狀）唾液酸平衡為開環(huán)（無環(huán)）形式。
2. 第二步遵循多步機制，其中DMB染料的伯氨基與α-酮酸的羰基反應形成亞胺，該中間體與溶液中的還原劑反應，從而與染料的其他伯胺反應。重排得到熒光標記的唾液酸（二亞胺）。

故障排除

1. HPLC上的低信號。
   • 酸水解不*：我們建議使用烘箱而不是加熱塊進行酸水解步驟。一些加熱塊導致樣品瓶蓋中的酸蒸發(fā)和冷凝，導致酸水解不*。我們還建議使用體積不超過0.5 mL的小樣品瓶進行酸水解。
   • 樣品中的鹽干擾標記：鹽和緩沖液可能干擾唾液酸

標記方法。如果懷疑鹽干擾樣本，分析前在無鹽溶劑中透析樣本。

1. 色譜圖中存在高水平的游離染料峰。
   • 這可能是由過多的光暴露引起的。確保孵育步驟在暗處進行。一旦樣品被標記，應立即在LC上運行，以避免降解，因為樣品長時間暴露于光照和高溫會導致非唾液酸特異性色譜峰增加。該問題也可能是由LC色譜柱隨時間的污染引起的，見下文。
   • 當DMB標記樣品時，Neu5Ac和Neu5Gc的量顯示穩(wěn)定

如果校準標準品在相同條件下儲存并同時進行分析，則在10 ℃下避光儲存長達72小時[參考文獻3]。如果不可能，則DMB標記的樣本可以冷凍長達2天[參考1]。

1. LC色譜峰保留時間的變化；基線不穩(wěn)定。
   • 錯誤或舊LC溶劑。始終以相同的方式制備溶劑（使溶劑達到  例如，通過將兩種溶劑混合在一起，量筒中的體積為1 l，與單獨測量兩種溶劑并在瓶中混合不同）。等度梯度對溶劑制備的變化特別敏感。由于蒸發(fā)，溶劑組成可能隨時間變化。
   • 過量游離染料/肽等污染色譜柱可導致保留時間偏移

和色譜圖上的額外峰。對于唾液酸化水平較低的樣品（將大量蛋白進樣至色譜柱中），這可能更成問題。用正常流動溶劑和乙腈的10:90混合物在正常流速下清洗色譜柱。

• (U)HPLC系統(tǒng)的運行條件尚未優(yōu)化。一個常見變量

評估您是否使用UHPLC，是“強/弱清洗”。這些可能對色譜產生顯著影響。作為一般規(guī)則，“弱清洗”使用弱梯度條件，“強清洗”使用強梯度條件。您需要評估其中哪些提供了與產品指南相匹配的SRP跟蹤。我們建議通過以下方式開始LC優(yōu)化  弱洗液。

1. 問題：標簽溶液中有沉淀
   • 盡管罕見，但在DMB標記溶液（連二亞*、巰基乙醇和DMB染料的混合物）的制備過程中可能會形成輕微沉淀。我們還觀察到了這種情況，檢測了該混合物的標記效率，并可以證實沉淀物不會影響標記反應。
2. 唾液酸參比組(SRP)(U)HPLC軌跡與指南中的不匹配
   • 確保該參比標準品未進行酸處理。酸處理后，SRP軌跡將僅包含Neu5Ac和Neu5Gc對應的峰。

保證和責任

Ludger保證上述產品符合隨附的分析文件。如果產品因誤用以外的原因失效，Ludger將根據其選擇免費更換或退還購買價格。本保證是排他性的，Ludger不作任何其他明示或暗示保證，包括任何暗示條件或任何特定用途的適銷性或適用性保證。

Ludger不對任何附帶、后果性或或或或有損失負責。本品僅用于體外研究。