預期用途

Eagle Biosciences MMAE（單甲基澳瑞他汀E）抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫分析試劑盒）預期用于定量測定供試品中的抗體-MMAE-偶聯(lián)物水平。可用于MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)的臨床前和臨床藥理學研究。

• 來自組織/細胞培養(yǎng)物的樣本和來自人、大鼠、小鼠、靈長類動物等的血清樣本?？芍苯优c本試劑盒配合使用。
• 基于人源化單克隆抗體的MMAE-ADC和基于小鼠單克隆抗體的MMAE-ADC均可用本試劑盒測定。

試驗原理

Eagle Biosciences MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒的設(shè)計、開發(fā)和生產(chǎn)用于定量測定血清中的抗體一甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶聯(lián)物。該測定法采用競爭性免疫分析技術(shù)，抗體僅與一甲基auristatin E結(jié)合。

將分析校準品（抗體MMAE偶聯(lián)物）和供試血清樣本直接加入包被有特異性抗MMAE抗體的微量滴定板的孔中。隨后，向每個孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的MMAE。在孵育期間，抗體MMAE偶聯(lián)物與HRP結(jié)合的MMAE競爭抗MMAE抗體的有限結(jié)合位點。包被良好的“抗MMAE抗體”免疫復合物

• 形成“HRP偶聯(lián)MMAE”。在隨后的洗滌步驟中除去未結(jié)合的抗體和緩沖液基質(zhì)。為檢測該免疫復合物，將微孔與底物溶液在定時反應(yīng)中孵育，并用酸性試劑（即ELISA終止液）終止反應(yīng)。然后在分光光度酶標儀中測定吸光度。與每個微量滴定孔壁結(jié)合的免疫復合物的酶活性與供試品中抗體-MMAE結(jié)合物的量成反比。通過在4參數(shù)或?qū)?shù)-對數(shù)曲線擬合上繪制每個校準品的吸光度與各自抗體-MMAE偶聯(lián)物濃度的曲線，生成校準曲線。根據(jù)校準曲線直接測定供試品中抗體-MMAE偶聯(lián)物的濃度。

試劑：制備和儲存

接收后，該人MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒必須在2-8 ℃下儲存。關(guān)于試劑盒的失效日期，請參閱試劑盒包裝盒上的標簽。所有組分在失效日期前均保持穩(wěn)定。

使用前使所有試劑恢復至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得合并或互換。

1. 抗-MMAE抗體包被微孔板（產(chǎn)品目錄號編號30748）

一個微孔板上有12 × 8個條帶（共96孔），包被有特異性抗MMAE抗體。將板框定并密封在含有干燥劑的箔拉鏈袋中。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

2. HRP結(jié)合的MMAE（貨號編號30685）

一個小瓶含有3 mL即用型HRP標記的MMAE，溶于穩(wěn)定的蛋白基質(zhì)中。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

3ELISA清洗濃縮液（產(chǎn)品目錄號編號10010）

1瓶含30 mL 30倍濃縮液。使用前，必須用870 mL去離子水稀釋內(nèi)容物并混勻。稀釋后，得到含有表面活性劑的工作清洗液，溶于磷酸鹽緩沖鹽水中，其中含有非疊氮化物、非汞防腐劑。稀釋的清洗液可在室溫下儲存，并在試劑盒包裝盒上標注的失效日期前保持穩(wěn)定。

4. ELISA HRP底物（貨號編號10020）

一瓶含15 mL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和*。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

5. ELISA終止液（貨號編號10030）

一瓶含15 mL終止液。本試劑可在2-8 ℃或室溫下儲存，在試劑盒包裝盒上標注的失效日期前可保持穩(wěn)定。

6. 抗體-MMAE偶聯(lián)零校準品（貨號編號30711）

一個裝有30 mL零校準品(30711)的小瓶。該試劑用于稀釋測定校準品的校準儲備液以及稀釋供試品。本試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，在試劑盒包裝盒上標注的失效日期前可保持穩(wěn)定。

7. 抗體-MMAE偶聯(lián)校準儲備液（貨號編號30712）

（試劑盒中未提供-可選）

一瓶(30712)含有抗體-MMAE-偶聯(lián)物的校準儲備液，溶于含非疊氮化物防腐劑的凍干(0.5 mL)血清基質(zhì)中。標準品的準確濃度參見小瓶。該試劑應(yīng)在2-8 ℃下儲存，并在試劑盒包裝盒上的失效日期前保持穩(wěn)定。

安全注意事項

人MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)檢測試劑盒試劑必須在專業(yè)實驗室環(huán)境中使用，僅供研究使用，不得用于診斷程序。僅牛血清試劑來源的原材料來自美國連續(xù)48個國家。僅從獸醫(yī)監(jiān)督下飼養(yǎng)的供體健康動物中獲得，發(fā)現(xiàn)無傳染病。進行本試驗時佩戴手套，并將這些試劑視為具有潛在傳染性進行處理。避免接觸含有TMB、*或硫酸的試劑。TMB可能會刺激皮膚和粘膜，引起皮膚過敏反應(yīng)。TMB是一種疑似致癌物。硫酸接觸皮膚可能引起嚴重刺激。請勿接觸眼睛、皮膚或衣服。請勿攝入或吸入煙霧。接觸后，用大量水沖洗至少15 min。使用藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范。

需要但未提供的材料

• 抗體-MMAE偶聯(lián)校準儲備液（貨號編號30712）
• 能夠遞送25µL、50µL和100µL等體積的精密單通道移液器。
• 重復適用于遞送100µL的分配器。
• 適用于上述體積分配的一次性移液器吸頭。
• 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。
• 帶蓋的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。
• 鋁箔。
• 去離子水或蒸餾水。 

• 塑料微量滴定孔蓋或聚乙烯膜。
• ELISA多通道洗瓶或全自動（半自動）洗滌系統(tǒng)。
• 能夠讀取450/650 nm或450/620 nm處吸光度的分光光度酶標儀。

試劑制備

1. 使用前，使所有試劑恢復至室溫。不同試劑盒批號的試劑不得組合或互換。
2. 使用前，必須將ELISA清洗濃縮液稀釋至工作溶液。詳細信息請參見試劑章節(jié)。
3. 用0.5 mL去離子水復溶校準儲備液30712。使用零校準品(30711)以1:X*稀釋復溶校準儲備液(30712)，以獲得濃度為4µg/mL的水平9校準品。通過1:2連續(xù)稀釋進一步創(chuàng)建校準品水平八至二，以獲得濃度為2µg/mL、1µg/mL、0.5µg/mL、0.25µg/mL的校準品。

0.125µg/mL、0.063µg/mL和0.032µg/mL。測定校準品應(yīng)在2小時內(nèi)使用，并應(yīng)儲存在-20 ℃以下。凍融循環(huán)次數(shù)不得超過3次。

1:X* 1:2 1:2 1:2 1:2 ……

X* = 30712/4的濃度

4. 測試配置

使用抗體-MMAE偶聯(lián)儲備液（產(chǎn)品目錄號編號30712）。為了訂購該校準品儲備液，請訂購Ab-MMAE結(jié)合儲備液（貨號編號30712）。

試驗程序

1. 將足夠數(shù)量的抗MMAE抗體包被微孔板條/孔置于支架上，以一式兩份運行人抗MMAE標準品、對照品和未知樣品。
2. 向微孔中加入100µL校準品和供試品。
3. 牢固密封板孔，用箔或其他材料遮光，在ELISA板振蕩器（小軌道半徑）上以400～450 rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30 min。
4. 立即向每個孔中加入25 μL HRP標記MMAE（目錄號30719）。（注：在加入HRP標記的MMAE之前無需進行洗滌步驟）
5. 牢固密封板孔，用箔或其他材料遮光，并在ELISA板振蕩器（小軌道半徑）上以400至450 rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)2 h±10 min。
6. 向各孔中加入350µL工作清洗液，清洗各孔5次，然后*吸出內(nèi)容物?；蛘?，可以使用自動微孔板洗板機。
7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。
8. 用鋁箔或其他材料覆蓋微孔板，避免暴露于光照下。將平板在室溫下靜置孵育20 min。
9. 立即向每個孔中加入100µL ELISA終止液。輕輕混合。
10. 讀取450 nm處的吸光度。

程序注釋

1. 建議所有校準品和未知樣本重復測定兩次。每份重復樣本的平均吸光度讀數(shù)應(yīng)用于數(shù)據(jù)簡化和結(jié)果計算。建議在每次檢測中添加外部質(zhì)控品。
2. 將光敏試劑保存在原始琥珀色瓶中。
3. 將任何未使用的抗體包被條儲存在含有干燥劑的箔拉鏈袋中，以防止受潮。
4. 為確保試驗的重現(xiàn)性，必須采用仔細的技術(shù)并使用適當校準的移液裝置。
5. 除本說明書中規(guī)定的孵育時間或溫度外，其他孵育時間或溫度可能影響結(jié)果。
6. 可使用軌道半徑較大（例如 > 1 cm）的軌道混合器，轉(zhuǎn)速為150-200 rpm。
7. 避免微孔中出現(xiàn)氣泡，因為這可能導致較低的結(jié)合效率和較高的重復讀數(shù)CV%。
8. 使用前，應(yīng)輕輕充分混合所有試劑。避免起泡。
9. 如果該測定適用于自動ELISA系統(tǒng)，如DS-2、DSX或Trituras，如果測定程序有任何修改，則需要進行程序驗證。

結(jié)果判讀

建議使用4參數(shù)或log-logit校準曲線擬合。

1. 計算每對重復檢測結(jié)果的平均吸光度。
2. 通過縱坐標上所有校準品水平的校正吸光度與校準品濃度生成校準曲線。應(yīng)使用適當?shù)挠嬎銠C輔助數(shù)據(jù)簡化程序進行結(jié)果計算。

使用各自的校正吸光度，從校準曲線中直接讀取供試品的抗體-MMAE偶聯(lián)物濃度。

示例數(shù)據(jù)和標準曲線

給出了人MMAE抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)ELISA檢測試劑盒的典型吸光度數(shù)據(jù)和所得標準曲線。不得使用該曲線代替每次試驗的標準曲線運行。

程序的局限性

1. 本試驗需要血清或血漿樣本進行檢測。
2. 不同種屬的血清或血漿樣本可能顯示不同的基質(zhì)背景。可能需要修改試驗程序以測量嚙齒類動物樣本。
3. 對于大于4µg/mL的樣本值，建議使用稀釋液（即，使用零校準品基質(zhì)的1:10或1:100稀釋液）重新測定樣本。該校準品零可從試劑盒制造商處獲得。由于基質(zhì)效應(yīng)，使用不同的緩沖液基質(zhì)進行樣本稀釋可能會導致假高或假低值。）。分析精密度和檢測結(jié)果位于標準曲線的15%B/B0至90%B/B0之間。
4. 細胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)樣品在使用前應(yīng)進行總結(jié)合率和其他性能標準的驗證。
5. 試劑盒校準品基于MMAE結(jié)合抗體或ADC濃度。它不是基于游離MMAE濃度。不同連接體和DAR中的MMAE-ADC可能產(chǎn)生不同的曲線偏移。

質(zhì)量控制

為確保結(jié)果的有效性，每次測定均應(yīng)包括適當?shù)馁|(zhì)控品。

性能特征

靈敏度

該MMAE ADC EIA的分析靈敏度(LLOD)約為0.0435µg/mL，通過8次零標準品(B0)重復測定的B0平均值以下的2倍標準偏差確定。

特異性

該MMAE-ADC EIA未顯示與MMAF-ADC、DM1-ADC和DUO-6-ADC的任何交叉反應(yīng)性。

高劑量“鉤狀”效應(yīng)

該試驗表明，高達1,000µg/mL的MMAE ADC水平?jīng)]有任何高劑量“鉤狀”效應(yīng)。

精密度

通過測量3個校準品（L3、L6和L8）的8次重復測定驗證批內(nèi)精密度。CV%為7.1%、6.7%和11.0%。

使用零校準品基質(zhì)稀釋兩份樣本并進行檢測。MMAE ADC稀釋回收率值結(jié)果如下：

加標回收率

將校準品水平4和6與校準品水平3、5和7等體積混合并檢測。結(jié)果如下：

1. 100µl校準品和未知樣本

在ELISA板振蕩器上室溫下孵育30 min

2. 25µl MMAE示蹤劑

在ELISA板振蕩器上室溫下孵育2小時洗滌5次